Szlak trzech kultur przebiega przez przygraniczne miasteczko Włodawę położoną nad wijącą się wśród pól, łąk i lasów rzeką Bug. To tu współistniały ze sobą trzy religie: katolicyzm, prawosławie i judaizm, a dowody tej koegzystencji przetrwały i są widoczne w architekturze sakralnej (kościół, cerkiew, synagoga) do dziś. Do II wojny światowej miasto było swoistym tyglem narodowościowym i kulturowym.